Protocolo de siembra celular – Guía sobre cómo sembrar células correctamente

Este artículo se publicó por primera vez en «Inside Cell Culture» , el boletín mensual para profesionales del cultivo celular. Encontrará más artículos interesantes sobre incubadores de CO₂ en nuestra página «Preguntas frecuentes y material sobre incubadores de CO₂» .

Dra. Jessica Wagener, especialista en aplicaciones de manipulación celular de Eppendorf

Índice de contenido

• El impacto de un protocolo de siembra celular estandarizado
• El factor tiempo y la sedimentación celular
• Vídeo: Técnica de pipeteo correcta
• Formación de burbujas de aire
• Vídeo: Cómo evitar la formación de burbujas de aire en la siembra celular
• Adhesión celular homogénea
• Comportamiento dependiente de la densidad celular

¿Por qué la siembra celular es un paso crítico en todos los experimentos de cultivo celular?

La siembra celular es, por lo general, el primer paso del protocolo y un procedimiento estándar en los experimentos basados en células. Un protocolo de siembra celular correcto y estandarizado es un factor crítico para obtener resultados experimentales reproducibles. El principal desafío en este paso consiste en lograr y mantener números de células comparables en todos los experimentos repetidos. Las variaciones en el número de células sembradas y la formación de burbujas de aire durante la siembra aumentarán las desviaciones estándar, haciendo que sus resultados sean menos fiables. Por lo tanto, es necesario considerar diversos factores al establecer un protocolo sólido de siembra celular en su laboratorio.

El factor tiempo en los protocolos de siembra celular

Al sembrar las células, por ejemplo, desde un tubo de 15 mL en una placa multipocillo, transcurrirá cierto tiempo hasta que haya llenado todos los pocillos. Independientemente de si utiliza una pipeta monocanal o multicanal en su protocolo de siembra celular, cuanto más tiempo dure el proceso, más células se sedimentarán en el tubo. Por lo tanto, si no se mezcla la suspensión celular en el tubo o en el reservorio, obtendrá números de células variables de un pocillo a otro (imagen 1).

El proceso de sedimentación celular es bastante rápido y ocurre en cuestión de minutos. Para evitar este efecto, es necesario resuspender o mezclar las células antes de la siembra con el fin de agitarlas y generar una solución homogénea. De esta forma, se garantiza un número igual de células por pocillo.

Vídeo: Técnica de pipeteo correcta en un protocolo de siembra celular

Formación de burbujas de aire durante la siembra celular

Los medios de cultivo celular tienden a formar espuma debido al alto contenido en proteínas del suero suplementado. Las burbujas de aire pueden dificultar la adhesión celular durante la siembra y, por lo tanto, crear variaciones en el número de células entre pocillos (imagen 2). Especialmente en los formatos de placa más pequeños, como las placas de 96 y 384 pocillos, las burbujas de aire pueden tener un gran impacto debido a la pequeña superficie de crecimiento por pocillo. Por lo tanto, aunque la resuspensión o mezcla es necesaria, no se debe exagerar; evite el pipeteo excesivo para reducir la formación de burbujas de aire. Un pipeteo suave también reduce las fuerzas de cizallamiento y el estrés de las células, lo cual es una parte crítica de todo protocolo de siembra celular.

Vídeo: Cómo evitar la formación de burbujas de aire en la siembra celular

Adhesión celular homogénea

Además de un número igual de células, una distribución celular homogénea en la superficie de crecimiento de un recipiente de cultivo puede repercutir en el resultado de su experimento. Existen diversas técnicas comunes que, por lo general, los científicos con más experiencia en el laboratorio las transmiten a sus aprendices. Pero, ¿cuál es el mejor método para distribuir uniformemente las células en la superficie de crecimiento? En la imagen 3, puede ver una comparación de diferentes técnicas.

A la izquierda, puede observar lo que ocurre si solo se llena previamente el recipiente con medio de cultivo celular, se añaden las células y se da por terminado el proceso. Como resultado, las células se adhieren principalmente en el centro del recipiente. Para lograr una distribución uniforme de las células, algunas personas utilizan un movimiento en forma de «ocho», mientras que otras prefieren un movimiento en forma de cruz de la placa o el recipiente. Ambas técnicas conducen a una mejor distribución de las células. Sin embargo, cuanto menor sea el diámetro del recipiente, menor será el movimiento del líquido, lo que provocará una distribución desigual de las células. Una forma eficaz de evitar este efecto durante la siembra de células consiste en diluir primero la suspensión celular hasta alcanzar la concentración deseada en un tubo o reservorio (mezcla maestra) y, a continuación, pipetear el volumen final en el recipiente de cultivo en un solo paso.

¿Importa la densidad celular?

La uniformidad de la distribución celular puede tener un impacto significativo en su experimento. Por supuesto, hay tipos de células que tienden a crecer en colonias en lugar de formar una monocapa homogénea. Pero, en general, las células deben extenderse de la manera más uniforme posible por toda la superficie de crecimiento del recipiente de cultivo. Un ejemplo que muestra el impacto directo de la distribución celular y las respuestas celulares es la eficiencia de transfección (imágenes 4 y 5).

Como se muestra en el gráfico, la mayor proporción de células transfectadas frente a las no transfectadas se consigue con una densidad celular media. Además, una eficiencia de transfección uniforme será el resultado de una capa celular distribuida de manera uniforme, generada al aplicar el enfoque de mezcla maestra. La consideración de ambos factores en un protocolo de siembra celular optimizará su eficiencia de transfección y reducirá la desviación estándar.